» » Получение проб крови и отдельных их компонентов

Получение проб крови и отдельных их компонентов

08.04.2015

Техника взятия крови. В зависимости от методов взятия и анализа крови необходимо подготовить: инструментарии — лезвие от безопасной бритвы и иглы иньекционные или для взятия крови, предварительно простерилизованные; смесители (меланжеры) с нанесенными на них десятью делениями, из которых пятое отмечено цифрой 0,5, а десятое — 1. За ампулообразным расширением одного из них нанесены цифры 101 для подсчета эритроцитов, а на другой — цифры 11 для подсчета лейкоцитов. Часто используют чистые, сухие и этикетированные пробирки Флоринского с 100-гнездным штативом; капилляр от гемометра Сали, гемометр Сали; градуированные пипетки на 2 и 20 мл; растворы для подсчета эритроцитов (1%-ный водный раствор натрия хлора) и лейкоцитов (3—5%-ный раствор ледяной уксусной кислоты, подкрашенный 1%-ным раствором метиленовой сипи, или одну кашпо насыщенного раствора метиленвиолета на 100 мл 3%-ной уксусной кислоты); 0,1 и. раствор НС1; дистиллированную воду, вагу, спирт и эфир (поровну) или настойку йода, противосвертывающие вещества — антикоагулянты; шлифованное и предметные стекла для приготовления мазков крови, чистую бумагу и простой карандаш для этикетирования мазков, пробирок или смесителей.
Взятие проб крови. Для морфологического анализа требуется очень небольшое количество крови. Поэтому у лошадей, мелкого и крупного рогатого скота и верблюдов кровь берут из какого-нибудь сосуда наружной или внутренней поверхности уха, а при необходимости и из яремной вены. У свиней кровь берут из уха шли хвоста (отрезая кончик), у плотоядных — из уха или Y. Saphena, кроликов и морских свинок — из сосудов уха, у верблюдов — путем прокола кожи па горбе, у крыс и мышей из хвоста, отрезая его копчик, у кур — путем прокола кожи шит гребня сережек (отрезая кусочек) и из вен крыла, у уток и гусей — из мякоти ступни ног.
Кровь из кровеносных сосудов наружной или внутренней поверхности уха животного берут путем укола инъекционной иглой пли разреза скальпелем (можно использовать лезвие от безопасной бритвы). Предварительно место укола или надреза очищают от грязи (если брать из наружной поверхности уха, то выстригают), протирают спирт-эфиром и просушивают сухой ватой. Эфир высушивает кожу и вызывает реактивное расширение сосудов после их первоначального сужения.
Для удобства работы левой рукой берут за верхний край правой ушной раковины и приоткрывают внутреннюю поверхность, а правой рукой протирают ватным тампоном, делают надрез вены и набирают кровь. При взятии проб крови из наружной поверхности уха большим и указательным пальцами левой руки придерживают копчик ушной раковины, а правой рукой делают укол кровеносного сосуда. При этом остальные три пальца левой руки поддерживают ухо с противоположной стороны, создавая твердую основу для укола.
Укол или надрез делают умеренной глубины, чтобы нс проколоть противоположную стенку сосуда. Если ранка небольшая, то кровь выделяется самопроизвольно небольшими каплями. Если же кровь вытекает слабо, ухо похлопать по противоположной стороне. При этом необходимо избегать разминания сосудов, грубого надавливания или протирания ватным тампоном, длительного ластов крови. В противном случае в вытекающую кровь попадает тканевая жидкость и состав крови может существенно измениться. Первые капли крови удаляют ватным тампоном, а последующие пробы берут для гематологических исследований.
В холодное время после укола или надреза кровь из сосудов выступает не сразу из-за их сужения. Если же уши животного теплые, сосуды хорошо заметны, кровенаполнены, капля крови выступает тут же после укола или надреза. Если кровь у животного из уха берут многократно, то следует уши чередовать или делать надрез сосуда сначала у кончика уха, а затем все ближе к его основанию. Это необходимо для устранения влияния местной реакции па показания крови. Фиксировать животное нужно все время одним и тем же методом, так как различные методы фиксации влияют па состав крови.
При массовых исследованиях животных кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагулянтами. На месте прокола выстригают шерсть и кожу дезинфицируют спиртом, 10%-ной настойкой йода или 0,5%-ным раствором карболовой кислоты. Большим пальцем левой руки слева у основания шеи нажимают па вену или накладывают резиновый жгут, что задерживает отток крови, и вена набухает в виде толстого шпура. Правой рукой вводят кровопускательную иглу, предварительно простерилизованную (путем кипячения в течение 5 мин), в вену под острым углом по направлению к голове, продвигая в полость сосуда приблизительно на 1 см. Если кровь не вытекает, рекомендуется иглу повернуть вокруг продольной оси и слегка продвинуть вперед пли назад.
Ecли кровь вытекала и вскоре после этого остановилась, значит, игла приняла неудобное положение или получился тромб, или прободены обе стенки вены. В этих случаях следует вынуть иглу и повторить манипуляцию другой иглой в другом месте вены.
Струю крови направляют на стенку пробирки, наполняя ее в зависимости от количества внесенного антикоагулянта и величины пробирки до 2/3 вместимости. После этого пробирку закрывают резиновой пробкой, тщательно перемешивают с антикоагулянтом и наклеивают этикетку. Очень важно не допустить свертывания крови. При использовании кондуктометрических счетчиков нельзя, чтобы в стабилизированную кровь попадали механические загрязнения волокон. Они могут вызвать частичную или полную закупорку микроотверстия, а это приводит к значительным погрешностям или делает невозможным подсчет. Стабилизированную кровь в термоизолирующей и амортизирующей упаковке необходимо немедленно транспортировать в ветеринарную лабораторию.
При взятии проб крови без антикоагулянтов приготовление мазков и зарядку смесителей или пробирок Флоринского делают быстрее, до свертывания или оседания па дно пробирки форменных элементов крови.
Стабилизация крови. Для гематологических исследовании желательно пользоваться свежеполученной кровью. Но в ветеринарной практике при массовых обследованиях и необходимости транспортировки крови па далекие расстояния приходится часто производить морфологические исследования крови через продолжительное время после ее взятия у животных. В этих случаях возникает необходимость стабилизировать кровь путем добавления специальных веществ-антикоагулянтов. К ним относятся нейтральные соли (сернокислый магний и сернокислый натрий) или вещества, способствующие инактивации в крови солей кальция — щавелевокислый натрий (оксалат натрия), лимоннокислый натрий (цитрат натрия). К антикоагулянтам относятся также вещества животного происхождения: гирудин, гепарин и др.
В последнее время в качестве антикоагулянта используют трилон Б (комплексоп-III, желатон, двунатриевая соль ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота).
В ветеринарной практике при камерном способе подсчета форменных элементов крови чаще всего применяют щавелевокислый или лимоннокислый натрий. При их использовании необходимо соблюдать дозировку указанных антикоагулянтов, так как с увеличением дозы этих стабилизаторов возникают качественные изменения главным образом со стороны цитоплазмы лейкоцитов, а это затрудняет не только окраску мазков крови, но и дифференциацию лейкоцитов, поэтому мазки желательно делать из нативной крови.
Наименьшие дозы антикоагулянтов, надежно стабилизирующие кровь животных и оказывающие незначительное отрицательное влияние на ее клеточный состав, следующие: лимоннокислого натрия 0,004 г или щавелевокислого натрия 0,002 г на 1 мл крови. В практических условиях, в частности в хозяйствах, рекомендуется использовать 3%-ный водный раствор оксалата натрия или 6%-ный раствор цитрата натрия. Эти растворы можно хранить и использовать в течение 6—7 сут без изменения свойств антикоагулянтов.
В пробирки (желательно типа Флоринского) глазной пипеткой вносят 3 капли 3%-пого раствора оксалата натрия (из расчета одна капля на 1 мл крови) или цитрата натрия. Для проведения морфологических исследований вполне достаточно 3 мл крови (из этого расчета и приведены дозировки указанных антикоагулянтов). Затем пробирки с антикоагулянтом устанавливают в наклонном положении в сушильный шкаф и жидкость выпаривают при температуре не более 100 °С.
При подсчете форменных элементов крови с помощью электронных счетчиков частиц используют трилон Б (двунатриевая соль ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота). Готовят 10%-ный водный раствор (на дистиллированной воде) и подогревают до 80 °С до полного растворения компонентов. Подогретый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр № 3 пли 4 или через четыре слоя фильтровальной бумаги. На 5 мл крови берут две капли приготовленного раствора филона Б. Кровь, стабилизированная филоном Б, пригодна для подсчета лейкоцитов с помощью электронного счетчика частиц в течение 48 ч, а другими антикоагулянтами — не более 1 сут с обязательным приготовлением мазков в первые 6 ч. Хорошие результаты можно получить при использовании антикоагулянта следующего состава: щавелевокислый аммоний (оксалат аммония) — 3 г; щавелевокислый натрий (оксалат натрия) — 2 г; вода дистиллированная — до 250 мл.
Указанный стабилизатор вносят мерной пипеткой (на 1 мл) в пробирки из расчета 0,2 мл на 1 мл крови (на 3 мл — 0,6 мл раствора). Затем пробирки помещают в сушильный шкаф при температуре не более 100 °C до полного испарения воды.
Приготовленные таким образом пробирки с указанными антикоагулянтами можно хранить при комнатной температуре в течение 10—20 дней. При несоответствии количества взятой крови с дозой внесенного в нее солевого антикоагулянта наблюдаются различные изменения в составе крови: если крови взято больше, чем нужно по расчету, то может произойти ее свертывание, если меньше — отмечается сморщивание эритроцитов (видны под иммерсионной системой объектива микроскопа в виде звездчатых клеток), а иногда и гемолиз. Кроме того, может быть понижение устойчивости клеток к механическим воздействиям при приготовлении мазков из стабилизированной крови. Это объясняется тем, что избыточное содержание солевых антикоагулянтов в плазме кропи повышает осмотическое давление, приводящее к сморщиванию эритроцитов.
Гепарин готовится в 1%-ном растворе на дистиллированной воде. Применяется из расчета две капли па 5 мл крови. После внесения пипеткой 1%-ного раствора гепарина в указанных количествах пробирки помещают в наклонном положении под углом 5—10° в сушильный шкаф и выпаривают жидкость при температуре не более 80—90 °С. Подготовленные таким способом пробирки с гепарином могут храниться длительное время в защищенном от света месте без изменения свойств антикоагулянта.
В качестве антикоагулянта можно также применять стабилизатор следующего состава (при использовании счетной камеры): трилон Б — 50 мг; 40%-ный формальдегид — 50 мл; дистиллированная вода — до 500 мл. Формалин, введенный в этот стабилизатор, уплотняет оболочку клеток, предохраняя их от разрушения при продолжительном хранении крови. Для стабилизации в пробирку с помощью пипетки вносят одну-две капли этого раствора на 3—4 мл крови. В подготовленные пробирки с указанными антикоагулянтами берут кровь, закрывают их резиновыми пробками и осторожно, не вспенивая содержимое, перемешивают для лучшего растворения антикоагулянта и его смешивания с кровью, равномерного распределения форменных элементов.
Пробирки с антикоагулянтом при хранении их в холодильнике (при -4 °С) пригодны для исследования в течение 10 дней. Холодильное оборудование должно постоянно поддерживать данную температуру. Kpoвь, стабилизированная трилоном Б, пригодна для подсчета лейкоцитов с помощью электронного счетчика частиц в течение 48 ч, а другими антикоагулянтами— не более 1 сут с обязательным приготовлением мазков в первые 6 ч.
При взятии крови нельзя допускать попадания в пробирки инородных частиц, которые могут вызвать погрешности при подсчете форменных элементов.
Работу с нитрированной кровью следует производить после взятая в более короткие сроки, так как в крови, предохраненной от свертывания, происходит ряд изменений, отражающихся на результате исследований,
В последующем при использовании крови, т. е. при приготовлении мазков и зарядке меланжеров или пробирок Флоринского, пробирку с кровью перевертывают несколько раз для лучшего и равномерного распределения форменных элементов в крови.
Плазма крови — жидкая кровь без содержания форменных элементов. Плазму можно получил, путем замедления или предотвращения свертывания крови при помощи антикоагулянтов, собирания крови в парафинированный сосуд или сильного ее охлаждения в момент взятия с последующим хранением на холоде. Полученная таким способом кровь при долгом стоянии или центрифугировании расслаивается па плазму (верхняя часть сосуда) и форменные элементы (внизу).
Дефибринированная кровь — выпадение фибрина из плазмы приводит к дефибринированию крови. Выпущенная из сосу да кровь через 5—15 мин свертывается, выделяя фибрин. В результате дефибринирования из плазмы получается сыворотка. Для полного дефибринирования свежеполученную кровь энергично взбалтывают во флаконах со стеклянными бусами в течение 15 мни с последующей фильтрацией ее через двойной слон марли. Фибрин остается на фильтре, а фильтрат при долгом стоянии или после центрифугирования в течение 5 мин при 3000 об/мин расслаивается на сыворотку и осадок форменных элементов крови.
Для получения суспензии эритроцитов из флакона отсасывают сыворотку, а осадок промывают повторно (3—4 раза) физиологическим 0,85%-ным раствором хлористого натрия с применением центрифугирования. Сущность процесса свертывания заключается в том, что при соприкосновении крови с инородными телами (кожа, шерсть, режущие инструменты) форменные элементы се выделяют фермент тромбокиназу (в циркулирующей крови ее нет), который в присутствии ионизирующих солей кальция переводит протромбин или тромбоген плазмы крови в тромбин, обладающий свойством превращать существующий в крови фибриноген в нерастворимое глобулиновое тело — фибрин.
Сыворотка крови — жидкая часть крови, образующаяся после ее свертывания и удаления. Для получения сыворотки кровь из яремной вены собирают в сосуд, направляя струю по его стенке, предотвращая при этом ее взбалтывание и вспенивание. Для свертывания крови сосуд кладут на 15—20 мин в теплое место (можно в термостат). По истечении этого срока для лучшего выделения сыворотки топкой чистой палочкой отделяют от стенок сосуда образовавшийся сгусток крови. Поверх сгустка в виде прозрачной, светлой, слегка желтоватой жидкости скапливается сыворотка. В последующем сосуд с кровью или сывороткой хранят в прохладном месте.
При долгом (более 2 сут) стоянии сосуда с кровью в теплом месте или в открытом виде наступает гемолиз. Эритроциты распадаются, кровь становится прозрачной, сыворотка — красной, непригодной для исследования. На качество сыворотки влияют также загрязнение, повторное замораживание и оттаивание, консервирование формалином, карболовой кислотой, подогревание и т. д.
Кровяной сгусток представляет собой склеенные между собой нитями и сгустками фибрина форменные элементы крови, образующиеся при свертывании последней. По мере выделения сыворотки (ретракция сгустка) кровяной cгусток постепенно уплотняется и уменьшается в объеме.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Информационный некоммерческий ресурс handcent.ru © 2022
При цитировании и использовании любых материалов ссылка на сайт обязательна

Яндекс.Метрика