» » Исследование физико-химических свойств крови

Исследование физико-химических свойств крови

29.03.2015

В процессе проведения занятия предусматривается выполнение пяти заданий, для которых необходимо подготовить соответствующие приборы, материалы и подопытных животных.
Приборы и материалы:
- для первого задания: стерильные иглы для взятия крови из яремной вены (Каспера, Боброва, Сайковича или др.) и получения капли крови (Франка, перо Дженнера или др.), ножницы изогнутые, резиновый жгут, закрутки и носовые клещи, стерилизатор, нагревательный прибор для стерилизации инструментов, ватные и марлевые тампоны, эфир или очищенный бензин, дезинфицирующие вещества (3 %-ный раствор карболовой кислоты, лизола, настойка йода и др.);
- для второго: обезжиренные и чистые предметные стекла, микроскопы, кюветы, дистиллированная вода, абсолютный этиловый спирт, смесь спирта и эфира (в равных частях), ацетон, краска азур-эозина (по Романовскому), раствор краски Лейшмана;
- для третьего и четвертого: пробирки Неводова, аппарат Панченкова, фарфоровые чашечки, штатив для пробирок, щавелевокислый натрий (порошок), 5 %-ный раствор лимоннокислого натрия;
для пятого: гемометр, фарфоровые чашечки, конский волос (обезжиренный), децинормальный раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, спринцовка с резиновым наконечником.
Задания:
1. Получить кровь от животных.
2. Приготовить и окрасить мазки.
3. Определить СОЭ у лошади по методу Неводова.
4. Определить СОЭ у мелких животных по методу Панченкова.
5. Определить количество гемоглобина (в процентах и грамм-процентах).
Порядок выполнения заданий.
Получение крови. Для лабораторных исследований небольшие количества крови берут из кровеносных сосудов внутренней поверхности ушной раковины, а также из краевой вены наружной поверхности кончика уха. У кур малое количество крови получают из гребня или сережек, у уток и гусей — из мякоти ступни ног.
Для получения малого количества крови лучше всего пользоваться оспопрививательным пером или острыми инъекционными иглами. У птиц удобно пользоваться иглой Франка или другими иглами. Кровь берут следующим образом:
1) коротко выстригают или выбривают волосяной покров на месте взятия крови;
2) протирают кожу спиртом, а затем эфиром. Если кожа сильно загрязнена, ее вначале моют теплой водой с мылом, просушивают ватой и обезжиривают эфиром;
3) наносят укол иглой. При уколе необходимо поддерживать ухо с наружной стороны пальцем. Чтобы избежать при этом ранение пальца, под него кладут ватный шарик;
4) первую каплю крови удаляют ватой, а из второй приготовляют мазок или заполняют меланжер. Кровь необходимо использовать возможно быстро, так как она быстро свертывается и становится непригодной для исследования;
5) после взятия крови место укола протирают спиртом или смазывают раствором йода.
Большое количество крови у лошадей, крупного и мелкого рогатого скота получают из яремной вены; свиней - из крупных сосудов уха или кончика хвоста; собак - из яремной вены или вен конечностей. Для этой цели пункцию вены производят инъекционной иглой или другими полыми иглами.
Кровь из яремной вены берут в нижней части верхней трети шеи. Большим пальцем левой руки зажимают вену. Правой рукой вводят в наполненный участок вены под острым углом стерильную кровопускательную иглу.
Кровь набирают в стеклянный сосуд (пробирки, мензурки и пр.), пуская ее по стенке сосуда, чтобы избежать образования пены.
Приготовление и окраска мазков. Для приготовления мазков крови надо подбирать стекла с ровной гладкой поверхностью, без царапин, выпуклостей и шероховатостей. Стекло должно быть абсолютно чистым, хорошо обезжиренным, очищенным от следов кислот и щелочей.
Предметное стекло берут за короткие ребра большим и средним пальцами левой руки и осторожно, ближе к одному из пальцев, касаются им капли крови.
Большим и указательным пальцами правой руки захватывают за ребра шлифованное покровное стекло (или предметное с отшлифованным краем) и под углом в 45° ставят его к стеклу с каплей.
Техника приготовления: легким движением надвигают стекло на каплю крови, дав ей возможность распределиться по всей ширине ребра стекла, подвигают его дальше, приготовляя мазок. Кровь при движении покровного стекла движется за ним и не подвергается травмированию.
Приготовленный мазок должен отвечать следующим требованиям: он должен быть достаточно длинным, тонким, ровным по густоте, без просветов и пустот. Мазок должен быть уже предметного стекла и иметь ровные продольные края. Приготовленный мазок следует защищать от действия паров воды и от мух.
Высушенный на воздухе мазок нумеруют. Номер и дату наносят пером или иглой посредине мазка.
Мазки крови перед окраской методом Романовского - Гимза фиксируют.
Мазки погружают в кюветку с налитым в нее абсолютным метиловым спиртом, покрывают крышкой и выдерживают в течение 5 минут.
Вынув из фиксатора, мазок высушивают на воздухе и красят.
Кроме метилового спирта можно воспользоваться и другими фиксаторами: абсолютным этиловым спиртом (20-30 минут), чистым ацетоном (5 минут), смесью спирта с эфиром в равных пропорциях (10—20 минут).
Окраски по Май-Грюнвальду и Лейшману не требуют специальной фиксации, так как фиксатор содержится в самой краске.
Из многочисленных методов окраски мазков крови наибольшее распространение имеют методы Романовского - Гимза и Лейшмана.
Окраска по Романовскому — Гимза. Для окрашивания применяют готовый раствор краски (по Романовскому). Перед употреблением краску разводят из расчета 1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды.
Зафиксированный препарат поместить на стеклянные палочки над сливной чашкой мазком вверх.
Покрыть всю его поверхность приготовленным раствором краски. Продолжительность окраски зависит от качества краски, ее концентрации, качества и температуры воды. В летнее время краску на мазке держат 15-20, зимой - 20, 30, 40 минут.
По окончании окраски препарат хорошо обмыть струей дистиллированной воды и высушить в вертикальном положении на пропускной (фильтровальной) бумаге.
Правильно окрашенный мазок должен иметь розоватый цвет с небольшим фиолетовым оттенком. Красный мазок указывает на избыток кислоты или недостаточную окраску, серый - на избыток щелочи.
Окраска по Лейшману. Мазок предварительной фиксации не требует.
Покройте препарат раствором краски Лейшмана (15-20 капель) и держите 3-5 минут.
По истечении времени, не сливая краски, осторожно прилейте к ней по каплям равное количество дистиллированной воды (15-20 капель).
Кисточкой, пипеткой или стеклянной палочкой осторожно перемешайте краску с водой.
Через 7-15 минут разведенную краску смойте дистиллированной водой.
Оставьте после обмывания на поверхности мазка на 1-2 минуты слой воды.
Мазок высушите в вертикальном положении.
Окрашенные мазки просматриваются под микроскопом.
Окраска по Май-Грюнвальду производится, как и по Лейшману, но раствором краски Май-Грюнвальда.
Определение СОЭ по методу Неводова. Ознакомьтесь с делениями эритроседиометра (пробирки) Неводова.
Насыпьте в пробирку Неводова на кончике ножа (0,03) порошок щавелевокислого натрия.
Произведите пункцию яремной вены и наполните пробирку Неводова до метки 0.
Закройте пробирку пробкой и переверните 10-15 раз (до полного растворения порошка).
Поставьте пробирку в штатив и наблюдайте за оседанием эритроцитов.
Через каждые 15 минут в течение часа записывайте в тетрадь результаты оседания эритроцитов. Последний раз уровень оседания эритроцитов отмечают через 24 часа.
Определите среднюю скорость оседания эритроцитов. Для этого складывают данные четырех измерений за час и полученную сумму делят на число измерений (4).
Определение СОЭ по методу Панченкова. Ознакомьтесь с устройством аппарата.
Смочите один из капилляров 5 %-ным раствором лимоннокислого натрия, а затем наберите этот же раствор до деления 25, выдуйте его на часовое стекло.
Наберите в капилляр кровь до метки 100 и выдуйте ее на часовое стекло в раствор, перемешайте. Если крови достаточное количество, то раствор можно брать до метки Р, тогда кровь набирают по полному капилляру 2 раза.
Наберите цитированную кровь в капилляр до метки К и установите в штатив.
Запишите в тетрадь результаты оседания эритроцитов. Учет реакции производят через 1 час и 24 часа.
Определение количества гемоглобина. Ознакомьтесь с гемометром Сали.
Налейте в градуированную пробирку до метки 10 децинормальный раствор соляной кислоты.
Произведите укол в кончик уха и первую каплю уберите ватой.
Наполните капилляр ровным столбиком крови до метки 20 (деление, соответствует 20 мм3), конец капилляра оботрите ватой.
Погрузите капилляр в раствор соляной кислоты, налитой в градуированную пробирку, осторожно выдуйте кровь и всасыванием (2-3 раза) из верхнего, прозрачного слоя кислоты промойте капилляр.
Легким ударом пальца по нижнему концу пробирки встряхивайте ее до полного растворения крови, при этом нужно следить за тем, чтобы не было сгустков свернувшейся крови.
Через 5 минут после выдувания крови прибавляйте в пробирку по каплям дистиллированную воду до получения одинакового окрашивания жидкости в пробирке с цветом стандартов. Чтобы получить равномерное окрашивание, необходимо жидкость в пробирке при добавлении дистиллированной воды тщательно перемешивать тонкой стеклянной палочкой или встряхиванием пробирки.
Определите, на каком уровне стоит мениск в пробирке, прочитайте по мениску количество гемоглобина в процентах Сали и грамм-процентах.
Запишите результаты исследований в тетрадь, сравните их с нормативами.
После окончания работы вымойте использованную в работе посуду.
Задание на внеурочное время.
1. Определить через 24 часа содержание красных кровяных телец в 1 мм3 крови по шкале эритроседиометра Неводова.
2. Прочитать через 24 часа конечное СОЭ, по Панченкову.
Занятие 10. Подсчет эритроцитов
При подсчете форменных элементов крови надо пользоваться только чистыми меланжерами, счетными камерами и покровными стеклами. He пачкайте камеру и покровное стекло жирными пальцами.
Приборы и материалы: меланжер, микроскоп, счетная камера, шлифованные покровные стекла, шар нагнетательный или спринцовка с мягким наконечником, обезжиренный конский волос, чашечки или часовые стекла, ножницы кривые, иглы для получения крови, физиологический раствор хлористого натрия, спирт, эфир.
Задание. Произвести подсчет эритроцитов.
Порядок выполнения задания.
Ознакомьтесь с приборами, которые рекомендуются для этого занятия.
Подготовьте поле (кончик уха у животного) для взятия капли крови.
Произведите укол в кончик уха.
Первую каплю крови уберите ватой, из второй засосите кровь в меланжер до отметки 0,5.
Быстро до метки 101 заполните остальную часть физраствором. При таком соотношении получится разведение крови в 200 раз. Если кровь набрать до метки 1, то разведение будет в 100 раз.
При наполнении смесителя необходимо следить за тем, чтобы во время насасывания не попадали пузырьки воздуха.
Зажмите концы меланжера большим и средним пальцами правой руки и плавными движениями смешивайте кровь с жидкостью до равномерного цвета. Если в расширении меланжера образовались не разбиваемые при встряхивании сгустки крови, то смеситель надо промыть и зарядить снова.
Выпустите из меланжера 3-4 капли на вату.
Возьмите счетную камеру и притрите к ней покровное стекло (до появления ньютоновых колец).
Поставьте микроскоп в рабочее положение, положите на его столик счетную камеру, прикройте диафрагму, найдите сетку камеры вначале под малым, а потом под большим (400) увеличением, хорошо ознакомьтесь с расположением больших и малых квадратов.
Поднимите тубус и нанесите каплю из меланжера на свободный край средней пластинки камеры. В силу капиллярности капля подтекает под покровное стекло. Успех равномерного заполнения камеры зависит от чистоты камеры и покровного стекла. Загрязненные камеры часто заполняются неравномерно. Нельзя допускать пузырьки воздуха на сетке камеры, а также попадания крови на поверхность стекла, так как это мешает точности подсчета. Стол, на котором стоит микроскоп, должен быть горизонтальным. Наклонять микроскоп нельзя.
Установите под малым увеличением левый верхний большой квадрат камеры (разбитый на 16 маленьких) и, убедившись, что эритроциты распределены равномерно, наведите сильное увеличение (в 400 раз). Если при сильном освещении сетки создается плохая видимость, то поле зрения микроскопа следует затемнить сужением диафрагмы или опусканием осветителя.
Сосчитайте количество эритроцитов в пяти больших квадратах (разделенных каждый на 16 маленьких) по диагонали или по углам сетки и посредине ее.
Для получения более точных результатов подсчета необходимо сосчитать большее количество квадратов. В целях избежания повторной записи одной и той же клетки подсчет начинают с маленького квадратика, расположенного в верхнем левом углу большого квадрата, затем переходят ко второму, третьему и четвертому квадратам верхнего ряда. Подсчитав верхний ряд, переходят ко второму, ведя счет в обратном направлении, т. е. справа налево. В третьем ряду ведут счет слева направо, а в четвертом снова справа налево.
В каждом маленьком квадрате считают эритроциты, находящиеся внутри на его левой и верхней линиях. Клетки, лежащие на правой и нижней линиях, подсчитывают в других квадратах. Клетки, расположенные в верхнем и нижнем левых углах, входят в сумму эритроцитов данного квадратика, а в нижнем и верхнем правых углах в эту сумму не входят.
Цифровые данные количества эритроцитов, найденных в каждом маленьком квадратике, записывают в таком же порядке, как идет счет.
Расчет: подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах умножают на 20000 при разведении крови 1:400, на 25000 при разведении 1:500 или на 30000 при разведении 1:600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умножают на 1000000 (10в12/л).
Сравните полученный результат с нормативами.
После работы камеру протрите тампоном, смоченным физраствором. Меланжер освободите от остатков крови и промойте его вначале физраствором, а затем спиртом и эфиром.
Продуйте меланжеры нагнетательным шаром или спринцовкой до высыхания.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Информационный некоммерческий ресурс handcent.ru © 2022
При цитировании и использовании любых материалов ссылка на сайт обязательна

Яндекс.Метрика